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scRNA-seq

2022-02-09 08:44:15 来源：今日健康网作者：分享：

文：寻药真理团

导语

目前，各种测序技术已经成为了药物研发过程中的得力工具。单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），简单从字面理解，就是一种在单细胞水平上对转录组进行测序分析的技术。目前，这项技术已经得到了广泛地应用，并在应用中不断地快速发展，成为我们研究细胞类别、疾病发生过程等问题的有力工具。

为什么要用scRNA-seq？

传统的批量测序（bulk RNA sequencing）有一个绕不过的难题：细胞的异质性。

众所周知，对于多细胞生物来说，尽管由同一个受精卵发育而来，但不同细胞之间的基因表达必然是有差异的，这些差异导致了细胞的分化，使不同的细胞承担不同的生理功能。粗糙地看，不同器官、组织的细胞组成不同，但使分析变得棘手的问题在于，即使是在形态上无法区分的细胞之间基因表达水平和对刺激的反应方面也存在很大的异质性，这种异质性在组织生物学和疾病的发展中起着重要作用，例如病原体细胞或癌细胞之间的表达异质性可能与人类疾病有关，在进行药物研发时，细胞的异质性也往往造成靶点难寻、耐药性等问题。

图1. 肿瘤异质性(Nature 2013 Vol. 501 Issue 7467 Pages 338-345)

在使用多细胞水平的分析时，每个细胞的异质信息很容易被掩盖在多个细胞的平均信息中。比如大家非常熟悉的Western blot。当我们使用Western blot检测蛋白质的含量时，我们无法区分目标蛋白是在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达。但如果使用流式细胞术，我们就可以清晰地区分上述情况。

图2. Western blot VS 流式细胞术(https://zhuanlan.zhihu.com/p/28844468)

单细胞转录组测序也是一样的道理。当使用bulk RNA-seq时，每个细胞的转录组差异同样会被多个细胞的平均信息所掩盖，而如果在单细胞水平对每个细胞进行分析，我们就可以得到异质性信息，进而可以对细胞进行更准确地分群、发现新的细胞种类、研究随机基因的表达，以及对细胞谱系路径进行探索。为药物研发提供更准确的信息，开辟新的路径，实现真正的“对症下药”。

图3. 单细胞测量保存了大量基因组分析丢失的关键信息(Genome Research 2015 Vol. 25 Issue 10 Pages 1491-1498)

自从2009年由汤富酬等人开发出第一种单细胞转录组测序技术，到今天已经有几十种不同的单细胞转录组测序技术被开发出来，它们各自有不同的优势与缺点，我们可以在了解不同技术的优缺点之后，选择最适合自己的研究的技术。

图4. scRNA-seq发展史

图5. 部分常用的scRNA-seq(Chen, G., et al. (2019). “Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.” Frontiers in Genetics 10(317).)

单细胞RNA测序技术原理

单细胞测序基本流程通常分为以下几个部分：单细胞分离、基因扩增、构建信息库、高通量测序、数据分析。单细胞分离技术分类众多，单细胞分离溶解后获得pg级的核酸，通过扩增至ng或μg级，然后用于后续的测序。目前常用单细胞分离方法有有限稀释法、显微操作（手工细胞采集）、激光捕获显微切割、荧光活化细胞分选、磁活化细胞分选、微流体技术等。

图6. 单细胞测序流程 (李勃,朵泓睿.单细胞RNA测序数据分析方法研究进展[J].重庆师范大学学报(自然科学版),2021,38(05):129-135+142.)

目前单细胞RNA测序常用技术有Tang RNA-seq、Smart-seq、Smart-seq 2、CEL-seq、Quartz-seq、STRT-seq、Drop-seq等，而利用这些技术构建的被大规模使用的测序平台有10xGenomics平台、Illumina®Bio-Rad® 平台、BD Rhapsody